Роль хроматографии в традиционной и биофармацевтике
Хроматографические методы применяются на каждом этапе жизненного цикла медикамента: от R&D до контроля готовой продукции, а также для выявления контрафактных препаратов.
Современная фармацевтика разделяется на два основных направления: традиционную (низкомолекулярные соединения) и биофармацевтику (сложные макромолекулы: гормоны, интерфероны, вакцины, моноклональные антитела). Хроматографические методы критически важны для обеих отраслей и применяются на каждом этапе жизненного цикла медикамента.
На этапе исследований и разработки (R&D) в традиционной фармацевтике хроматография используется для очистки кандидатов, подтверждения идентичности, профилирования примесей и изучения метаболизма. В биофармацевтике аналитические техники применяются для получения характеристик активных молекул: установления размера белков, пептидного картирования, подтверждения последовательностей и количественного анализа.
Отдельную роль хроматография играет в борьбе с фальсификатами. Контрафактные препараты могут содержать неверную дозу, опасные загрязнения, неуказанные ингредиенты или вовсе не иметь действующего вещества. Даже небольшие изменения в составе меняют фармакокинетику препарата, делая его опасным для пациента. Хроматографический «отпечаток» позволяет однозначно идентифицировать подлинность лекарственного средства и выявить любые отклонения от оригинальной рецептуры.
Контроль нелетучих примесей и действующего вещества
Для определения нелетучих примесей и действующего вещества используется ВЭЖХ с различными типами спектрофотометрических детекторов, позволяющими оценивать чистоту пиков.
Производственный контроль осуществляется в соответствии с фармакопейными статьями и включает входной контроль сырья и мониторинг готовой продукции. Нелетучие органические примеси представляют собой побочные и промежуточные продукты химического синтеза. Они могут присутствовать в значительных концентрациях даже несмотря на оптимизированный производственный процесс, а в следовых количествах должны быть охарактеризованы и проверены на соответствие нормативам.
Определение действующего вещества и нелетучих органических примесей проводится на высокоэффективном жидкостном хроматографе, оснащённом спектрофотометрическим детектором одного из следующих типов:
| Тип детектора | Особенности применения |
|---|---|
| УФ-ВИД (перестраиваемый) | Регистрация сигнала на одной длине волны. Обладает самой высокой чувствительностью и наименьшим дрейфом базовой линии, но не даёт возможности проверить спектральную чистоту пика. |
| Многоволновой | Одновременная регистрация до 8 сигналов на длинах волн, характерных для определяемых соединений. Позволяет контролировать несколько компонентов за один анализ. |
| Диодноматричный (ДМД) | Работа в одноволновом, многоволновом и спектральном режимах. Специализированное ПО позволяет анализировать чистоту хроматографических пиков, отслеживая присутствие скрытых примесей внутри основного пика. |
Анализ остаточных растворителей: классы опасности и методы ГХ
Остаточные растворители классифицируются по токсичности согласно ICH Q3C. Для их анализа применяется газовая хроматография с парофазным пробоотборником (HS-GC).
Остаточные растворители – это летучие органические соединения, используемые или образующиеся при изготовлении активных фармацевтических ингредиентов (АФИ) и препаратов. Поскольку они не обладают терапевтическим эффектом и могут быть токсичны, их содержание строго регламентируется. Согласно руководствам ICH Q3C, USP 467 и Европейской фармакопеи, растворители делятся на три класса:
-
• Класс 1 (недопустимая токсичность): Бензол, четыреххлористый углерод, 1,2-дихлорэтан. Известны как канцерогены и мутагены. Использование должно быть полностью исключено.
• Класс 2 (ограниченная токсичность): Ацетонитрил, метиленхлорид, метанол, толуол. Требуют строгого контроля пределов концентрации в зависимости от потенциального риска для здоровья.
• Класс 3 (низкая токсичность): Этилацетат, изопропанол, пропиленгликоль. Обладают высоким допустимым лимитом суточного поступления и считаются относительно безопасными.
Предпочтительным методом анализа является газовая хроматография в сочетании с парофазным пробоотборником (HS-GC). Этот метод позволяет извлекать летучие соединения из сложных жидких и твердых матриц быстрым способом без трудоемкой подготовки проб, предотвращая загрязнение колонки нелетучими компонентами. В качестве детектора чаще всего используется пламенно-ионизационный (ПИД/FID) для рутинного контроля или масс-спектрометрический (МС) для идентификации неизвестных примесей. Растворители класса 3 могут определяться неспецифическим методом потери веса при высушивании.
Вымываемые и извлекаемые вещества из упаковки
Полимерная упаковка может выделять пластификаторы, олигомеры и чернила, которые мигрируют в препарат. Контроль этих загрязнений требует комбинации ГХ и ЖХ с масс-спектрометрическим детектированием.
К летучим и полулетучим примесям относятся не только остаточные растворители, но и компоненты, извлекаемые и вымываемые из полимерной упаковки. Извлекаемые загрязнения (extractables) – это пластификаторы, олигомеры, чернила и антиоксиданты, которые мигрируют из упаковочного материала при экстремальных условиях (высокая температура, давление, органические растворители). Вымываемые загрязнения (leachables) выщелачиваются при стандартных условиях хранения препарата.
Выделяемые материалом упаковки соединения бывают опасны как сами по себе, так и вследствие возможного взаимодействия с лекарственным препаратом, приводя к деградации активного вещества или образованию новых токсичных продуктов. Для контроля перечисленных примесей в основном применяется газовый хроматограф с дозатором равновесного пара, но для определения ряда нелетучих пластификаторов целесообразен ввод жидкой пробы. Прибор комплектуется либо пламенно-ионизационным, либо масс-селективным детектором. МС-детектор предпочтителен для идентификации неизвестных мигрантов.
Проблема нитрозаминов и генотоксичных примесей
Обнаружение N-нитрозаминов в сартанах и ранитидине привело к ужесточению требований FDA и EMA. Для контроля генотоксичных примесей требуются сверхчувствительные методы LC-MS/MS и GC-MS/MS.
Отдельное внимание в последнее время уделяется генотоксичным и мутагенным загрязнителям в фармацевтическом сырье и готовой продукции. Недавно Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) и Европейское агентство по лекарственным средствам (EMA) обнаружили в нескольких сартанах (лекарства от артериального давления) и ранитидине (таблетки от изжоги) примеси N-нитрозаминов (NDMA, NDEA, NMBA). Это привело к массовому отзыву препаратов и разработке новых, более строгих руководящих документов для выявления мутагенных примесей.
Чтобы соответствовать новым требованиям, необходимы наиболее чувствительные аналитические методы – такие, как жидкостная хроматография в сочетании с тройной квадрупольной масс-спектрометрией (LC-MS/MS) и масс-спектрометрией высокого разрешения. Тем не менее, Управлением тестирования и исследований FDA разработан и метод, предусматривающий использование моноквадрупольного газового хромато-масс-спектрометра и дозатора равновесного пара, что делает задачу контроля более доступной для лабораторий, не располагающих тандемными МС-системами.
Специфика анализа биофармацевтических препаратов
Биофармацевтика требует контроля не только химической чистоты, но и высшей структуры белка, аминокислотного состава и посттрансляционных модификаций.
Для биофармацевтических производств жизненно важной процедурой является определение уникального аминокислотного состава белка или пептида. Это позволяет сравнить разные партии сырья и удостовериться в постоянстве их состава, что критически важно для воспроизводимости терапевтического эффекта. Анализ осуществляется с использованием высокоэффективного жидкостного хроматографа, укомплектованного спектрофотометрическим и флуориметрическим детекторами. Возможны варианты как с предколоночной дериватизацией в автосамплере, так и с постколоночной дериватизацией.
Аналогичное оборудование используется для контроля аминокислотного потока в культивируемых клетках, который является существенным показателем скорости метаболизма и здоровья клеток при производстве биопрепаратов. Кроме того, для характеристики биофармацевтических молекул широко применяются эксклюзионная хроматография (SEC) для определения агрегатов, ионообменная хроматография (IEX) для анализа зарядовых вариантов и гидрофобная интеракционная хроматография (HIC) для оценки конформационных изменений.
Контроль качества растительных лекарственных средств
Растительные препараты содержат множество компонентов с естественными вариациями. Хроматография используется для стандартизации, скрининга активных веществ и контроля пестицидов.
Растительные лекарственные средства могут быть очень сложными по составу, содержать большое число химических компонентов и иметь множество естественных вариаций в зависимости от места произрастания, времени сбора и условий хранения. Хроматографические методы используются для установления строения, идентификации и скрининга активных компонентов, а также для исследования фармакологии с целью получить научно обоснованное подтверждение эффективности подобных препаратов.
При изготовлении растительных лекарственных препаратов хроматографические методы анализа применяются для решения следующих задач:
• контроль качества сырья, экстрактов и готовой продукции;
• мониторинг изменений ключевых компонентов в процессе производства;
• фиксация точек исходного и изменённого состояния
• мониторинг загрязняющих веществ, таких как пестициды и микотоксины;
• количественная оценка ключевых маркерных компонентов и подтверждение соответствия нормативным требованиям.
Валидация оборудования и требования GMP
Валидация хроматографов и ПО является обязательным требованием GMP (Приказ Минпромторга РФ № 916). Лаборатория должна документально подтвердить пригодность системы на всех этапах квалификации (IQ/OQ/PQ).
Организация контроля качества лекарственных средств регулируется Правилами надлежащей производственной практики (стандарт GMP). В России данные правила утверждены приказом Министерства промышленности и торговли РФ от 14.06.2013 г. № 916 (в ред. от 18.12.2015 г.). Обязательной процедурой в рамках GMP является проведение валидации (квалификации) лабораторного оборудования, и хроматографы не являются исключением. Результаты должны быть оформлены документально.
Суть процедуры заключается в том, что лаборатория должна быть уверена, что используемое оборудование предоставляет соответствующие действительности аналитические результаты. Для этого формулируются рабочие спецификации (URS). Если речь идёт о новом оборудовании, оно устанавливается поставщиком, который обязан предоставить свидетельства соответствия требуемым спецификациям в виде отчёта по валидации. Валидируется не только прибор, но также его программное обеспечение и лабораторная информационная система (ЛИС), в которую он интегрирован, что гарантирует целостность данных (Data Integrity) и прослеживаемость результатов.
Оценка пригодности хроматографической системы
Испытания пригодности системы являются неотъемлемой частью каждой фармакопейной методики и включают проверку эффективности, разрешения, повторяемости и чувствительности.
Согласно общей фармакопейной статье, испытания пригодности системы являются неотъемлемой частью методики и используются для того, чтобы убедиться в надлежащем функционировании хроматографической системы. Соответствие критериям пригодности должно поддерживаться на протяжении всего испытания. Основные критерии:
-
• Фактор асимметрии (As): должен находиться в пределах от 0,8 до 1,8 для пика стандартного образца.
• Разрешение (Rs): ≥ 1,5 для критичной пары пиков. При неполном разделении используется соотношение «пик/долина» (p/v).
• Отношение сигнал/шум: не менее 10 для предела количественного определения (ПКО).
• Повторяемость (RSD): относительное стандартное отклонение площадей или высот пиков не должно превышать установленный предел.
Порог игнорирования (reporting threshold), ниже которого пик не учитывается, по умолчанию составляет 0,05% от содержания основного вещества. Интегрирование площади пика примеси, не полностью разделяющейся с основным пиком, проводится как «пик-наездник», если иное не оговорено в методике.
Допустимые корректировки хроматографических условий
Фармакопея допускает ограниченные корректировки параметров без ревалидации методики. Корректировка градиентных условий требует особой осторожности и учёта объёма задержки градиента.
Приведённые в методике хроматографические условия валидируют при её разработке. Тем не менее, для выполнения требований пригодности системы на практике может потребоваться корректировка. Фармакопея устанавливает допустимые пределы изменений, выход за которые требует ревалидации методики:
| Параметр | Допустимая корректировка (ВЭЖХ изократическая) | Допустимая корректировка (ГХ) |
|---|---|---|
| Скорость потока | ±50% | ±50% |
| Температура колонки | ±10 °C | ±10 °C (программа: ±20%) |
| pH водного компонента | ±0,2 ед. pH | — |
| Концентрация солей буфера | ±10% | — |
| Состав подвижной фазы (мин. компонент) | ±30% отн. или ±2% абс. | — |
| Длина волны детектора | Изменения не допускаются | — |
| Тип неподвижной фазы | Замена недопустима | Замена недопустима |
Корректировка условий градиентного элюирования является более критичной, чем изократических, так как может вызвать сдвиг пиков на другую стадию градиента и привести к наложению пиков или изменению порядка элюирования. При градиентном элюировании температура колонки может изменяться только на ±5 °C. Также необходимо учитывать объём задержки градиента конкретной системы, который может отличаться от объёма системы, использованной при разработке методики. Для адаптации может потребоваться введение или корректировка изократической стадии перед началом градиента.
Многочисленные корректировки могут оказывать кумулятивное воздействие на работоспособность системы и должны быть правильно оценены пользователями. Несоблюдение регламента периодического обслуживания и валидации может привести к аннулированию результатов анализов и приостановке действия лицензии предприятия. Рекламации, связанные с ухудшением характеристик из-за пренебрежения регламентными работами, устраняются за счет владельца лаборатории.
Часто задаваемые вопросы
Растворители 1 класса обладают недопустимой токсичностью (канцерогенность, мутагенность). К ним относятся бензол, четыреххлористый углерод, 1,2-дихлорэтан, 1,1-дихлорэтен и 1,1,1-трихлорэтан. Их использование в производстве должно быть полностью исключено или сведено к абсолютному минимуму.
Биофармацевтические препараты (белки, антитела) требуют контроля не только химической чистоты, но и высшей структуры, аминокислотного состава, степени гликозилирования и агрегации. Для этого используются специализированные методы ВЭЖХ (SEC, IEX, HIC), пептидное картирование и масс-спектрометрия высокого разрешения.
Порог игнорирования (reporting threshold) – это уровень содержания вещества, ниже которого пик не учитывается при расчетах. Согласно общей фармакопейной статье, если нет других указаний, этот порог составляет 0,05% от содержания основного вещества.
Фармакопея допускает ограниченные корректировки (adjustable parameters) без повторной валидации: скорость потока ±50%, температура колонки ±10 °C (для ГХ) или ±5 °C (для градиентной ВЭЖХ), pH буфера ±0,2 ед., концентрация солей ±10%. Замена типа неподвижной фазы и длины волны детектора недопустима.
Оснащение фармацевтических лабораторий: решения ПрофЛаб
Соответствие стандартам GMP и требованиям Фармакопеи требует использования сертифицированного и валидированного оборудования. Компания ПрофЛаб предлагает комплексные решения для контроля качества лекарственных средств: от газовых и жидкостных хроматографов до систем автоматизации ввода проб и масс-спектрометрических детекторов.
Наши специалисты помогут подобрать конфигурацию прибора под конкретные фармакопейные методики, проведут квалификацию оборудования (IQ/OQ/PQ) и обеспечат регулярное техническое обслуживание. Для получения консультации оставьте заявку на сайте или свяжитесь с нами:
8 (800) 100-98-81
Бесплатный звонок по России
info@proflabspb.ru
Напишите нам в любое время
Мы гарантируем соответствие поставляемого оборудования международным стандартам качества и оказываем поддержку на всех этапах внедрения аналитических методов в вашей лаборатории.